CRISPR/Cas9 als molekularbiologische Methode: Wie funktioniert sie?

CRISPR/Cas9, das bakterielle System zur Immunabwehr, wurde für die Anwendung im Labor umgemünzt und entwickelte sich zu einer bahnbrechenden Methode in der Molekularbiologie. Wie funktioniert diese Methode?

Kristallstruktur von Cas9 im Komplex mit der sgRNA und der Ziel-DNA

Kristallstruktur von Cas9 im Komplex mit der sgRNA und der Ziel-DNA (Target DNA). Bild: Nishimasu H et al./Wikimedia Commons, CC-Lizenz

CRISPR/Cas9: Gentechnik erreicht neue Dimensionen

Im Laboralltag sind Forschende regelmässig darauf angewiesen DNA zu verändern, um z. B. die Funktion bestimmter Proteine zu untersuchen. Es gibt bereits verschiedene Methoden, die eine sogenannte Genomeditierung ermöglichen, CRISPR/Cas9 aber gilt inzwischen als die Methode der Wahl, wenn es darum geht DNA an einer präzisen Stelle zu schneiden (warum das so ist, kannst du im Artikel "Genomeditierung vor dem CRISPR/Cas- Zeitalter" nachlesen). Die Schwierigkeit ist nicht die DNA zu schneiden – dafür gibt es Enzyme, die schon lange bekannt sind – sondern sie an einer definierten Stelle zu schneiden. Das Genomeditierungs-System benötigt also zusätzlich zum Schneidewerkzeug einen Mechanismus, der die gewünschte DNA-Zielsequenz erkennt.

gRNA und Cas9: Erkennen und schneiden

Diese zwei Elemente, die das Fundament der CRISPR/Cas9-Methode bilden, sind die gRNA (guide RNA, was so viel heisst wie führende oder leitende RNA; oft auch single guide RNA genannt) und das Cas9-Protein (CRISPR assoziiertes Protein), die eigentliche "Genschere". Die beiden Elemente bilden zusammen einen Komplex. Die gRNA wird im Labor so synthetisiert, dass sie zur DNA-Zielsequenz komplementär ist – sie erkennt also das Ziel, das geschnitten werden soll. Meist ist sie ca. 17-21 Nukleotide lang; damit wird sichergestellt, dass die Sequenz möglichst nur einmal im Genom vorkommt und es keine Schnitte ausserhalb der gewünschten Region gibt (s. aber den Artikel "CRISPR/Cas: Fragen und Regeln"). Bevor aber der gRNA/Cas9-Komplex die DNA-Sequenz erkennen und schneiden kann, muss er erst mal an sie herankommen.

PAM-Motiv: Sesam öffne dich

PAM-Motive sind nichts anderes als kurze Sequenzen auf der DNA, die von Cas-Proteinen erkannt werden. Im Falle von Cas9, das aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes isoliert wurde, handelt es sich dabei um die Sequenz NGG, wobei N jedes Nukleotid sein kann. Das Cas9-Protein bindet an ein PAM-Motiv und entwindet die DNA-Helix an dieser Stelle – nun ist die DNA-Sequenz zugänglich und kann theoretisch geschnitten werden.

Dass die PAM-Motive nur wenige Nukleotide lang sind, ist für die Gentechnik ein Vorteil. Solch kurze Nukleotidsequenzen kommen im Genom relativ häufig vor, so dass meist mehrere PAM innerhalb eines Gens zu finden sind. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine PAM in der Nähe der gewünschten Zielsequenz ist, die geschnitten werden soll, ist somit gross. PAM-Motive kommen aber trotzdem nicht immer genau dort vor, wo man die DNA schneiden möchte. Forschende haben aber neben dem Cas9 auch ganz viele andere Cas-Proteine entdeckt, die alle ähnlich funktionieren, aber unterschiedliche PAM-Motive ansteuern. Dies ermöglicht eine flexiblere und noch gezieltere Genomeditierung.

Das CRISPR/Cas9-System

Das CRISPR/Cas9-System. Hier hat Cas9 das PAM erkannt und die DNA entwunden. Da die gRNA zur DNA komplementär ist, wurde ein Schnitt durch beide Stränge gemacht. Bild: Mariuswalter/Wikimedia Commons, CC-Lizenz

Wie geht nun das Ganze vor sich?

Der gRNA/Cas9-Komplex tastet die DNA ab. Erkennt Cas9 ein PAM-Motiv auf der DNA, bleibt es stehen und öffnet die Doppelhelix. Passt die gRNA nicht zu der nun zugänglichen DNA-Sequenz, geht der Komplex weiter, bis er auf das nächste PAM-Motiv trifft. Sind aber die DNA-Sequenz und die gRNA komplementär, bewirkt das eine Konformationsänderung im Cas9-Protein. Es wird nun als Nuklease aktiv und schneidet beide Stränge der DNA glatt durch.

Der gRNA/Cas9-Komplex hat die DNA entwunden und nach Basenpaarung der gRNA mit der DNA den DNA-Doppelstrang geschnitten. Die Zelle repariert die DNA über nicht-homologe Endverknüpfung (links; non-homologuous end joining) oder – wenn eine Vorlage (Donor DNA) vorhanden ist – über homologe Rekombination (rechts). Im ersten Fall können Mutationen entstehen, was zur erwünschten Inaktivierung des Gens führen kann, im zweiten Fall kann ein fremdes Gen eingeführt werden. Bild: Mariuswalter/Wikimedia Commons, CC-Lizenz


 

Und nach dem Schnitt?

Durch dieses Schneiden entsteht ein Doppelstrangbruch in der DNA, den die Zelle durch ihre eigenen Reparaturmechanismen (sogenannte nicht-homologe Endverknüpfung) möglichst schnell zu reparieren versucht. Diese Reparatur ist aber oft mit kleinen Fehlern verbunden, was dazu führt, dass die DNA häufig etwas abgeändert wiederhergestellt wird (es können ein paar Basenpaare herausgeschnitten oder hinzugefügt werden). Diese fehlerhafte Reparatur hat eine editierte DNA-Sequenz zur Folge.

Und was bringt das?

Diese Art der Genomeditierung wird häufig benutzt, um Gene komplett auszuschalten, da eine Veränderung von ein paar Basenpaaren bereits zu einem inaktiven Genprodukt (Protein) führen kann. Für andere Anwendungen kann eine Vorlage für die DNA-Reparatur in die Zelle eingeschleust werden, damit ein Teil eines Gens oder das ganze Gen durch ein anderes gezielt ersetzt werden kann. Man spricht dann von einer homologen Rekombination. Anwendungsbeispiele sind im Artikel "CRISPR/Cas: Eine Methode, viele Anwendungen" aufgeführt.

Warum diese Methode als Revolution in der Molekularbiologie gefeiert wird, kannst du im Artikel "Genomeditierung vor dem CRISPR/Cas-Zeitalter" lesen.

CRISPR/Cas9: Was ist das für ein Name?

Der Begriff CRISPR stammt aus einem bakteriellen Immunmechanismus* und bezeichnet bestimmte DNA-Abschnitte, die im Werkzeug, das im Labor benutzt wird, gar nicht vorkommen . Dennoch wird der Begriff in der Bezeichnung der Methode verwendet. Cas9 bezeichnet das Enzym, das die DNA schneidet. Wir beziehen uns im Artikel manchmal auf den gRNA/Cas9-Komplex, was uns in dem Zusammenhang etwas plausibler erscheint. Meist wird von der CRISPR/Cas9-Methode gesprochen, inzwischen sind aber viele weitere Cas-Enzyme entdeckt worden.

*Die CRISPR/Cas9-Methode beruht auf einem adaptiven Abwehrmechanismus von Bakterien. Bakterien benutzen diesen Mechanismus, um gefährliche Viren abzuwehren und um sich eine Art "Erinnerung" aufzubauen, damit die Abwehr bei wiederholten Infektionen schneller geschehen kann. Der Mechanismus ist also vergleichbar mit unserem Immunsystem, aber um ein Vielfaches einfacher aufgebaut. Mehr zu diesem Thema findest du im Artikel "CRISPR/Cas9 – Bakterien revolutionieren die Molekularbiologie".

Die erste wissenschaftliche Publikation, welche die CRISPR/Cas9-Methode vorgestellt hat, kam aus den Labors der Wissenschaftlerinnen Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna. Es wird auch gemunkelt, dass diese Entdeckung nobelpreiswürdig ist.

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